三、RNA-seq文库构建的核心步骤

（1）RNA提取与质控
- 使用Trizol或柱式提取法从样本中提取总RNA
- RNA完整性评估：Agilent Bioanalyzer检测RIN值（RNA Integrity Number）
- RIN > 7通常被认为是良好质量的RNA；RIN < 5可能导致3'端偏倚
（2）RNA富集或rRNA去除
- mRNA富集：使用oligo(dT)磁珠捕获带poly(A)尾的mRNA
- 优点：简单高效
- 缺点：会丢失不带poly(A)尾的RNA（如部分lncRNA、原核生物mRNA）
- rRNA去除：使用rRNA探针杂交去除rRNA（Ribo-Zero, Ribo-off等）
- 优点：保留所有非rRNA（包括mRNA、lncRNA、circRNA等）
- 缺点：操作稍复杂，成本略高
（3）RNA片段化与cDNA合成
- 片段化：使用二价阳离子（如Mg²⁺）在加热条件下将RNA随机打断成200-300 nt片段
- cDNA合成：
- 第一条链：使用随机六聚体或oligo(dT)引物，逆转录酶合成
- 第二条链：使用DNA聚合酶合成互补链（通常掺入dUTP以标记第二条链，用于链特异性文库）
（4）文库构建
- 末端修复：将cDNA片段末端补平
- A尾添加：在3'端添加单个A碱基
- 接头连接：连接带有barcode的测序接头
- PCR扩增：扩增文库至足够浓度
- 文库质控：检测文库大小分布（Agilent Bioanalyzer）和浓度（Qubit/qPCR）
（5）测序策略
- 单端测序（Single-end）：只测cDNA片段的一端，成本较低
- 双端测序（Paired-end）：测序两端，可更好地定位reads和识别可变剪接
- 链特异性测序（Strand-specific）：保留RNA链方向信息，可鉴定反义转录本