三、三代测序技术

（1）PacBio SMRT测序
PacBio测序的核心是零模波导孔（ZMW）技术：
- 在芯片上蚀刻数十万个直径约70 nm、深度约100 nm的纳米孔
- 每个孔底部固定一个DNA聚合酶分子
- 待测DNA与引物结合，被聚合酶捕获
- 加入四种带有不同荧光标记的dNTP（标记在磷酸基团上，而非碱基上）
- 当dNTP被掺入新链时，荧光标记被释放到溶液中，产生闪光信号
- 记录每个ZMW中的闪光序列和时间，即可获得DNA序列
PacBio Sequel II可产生约15-20 kb的长读长，最新的Revio系统进一步提高了通量。通过环化一致性测序（CCS，Circular Consensus Sequencing），同一个分子多次循环测序，可获得准确性>99.9%的HiFi reads。
（2）Nanopore测序
Nanopore测序的核心原理：
- 蛋白质纳米孔嵌入脂质双分子层膜中
- 在膜两侧施加电压，产生离子电流
- DNA/RNA分子在动力蛋白（helicase）驱动下穿过纳米孔
- 不同碱基（或k-mer）穿过纳米孔时引起特征性的电流变化
- 通过深度学习模型（如Bonito、Dorado）将电流信号解码为碱基序列
Nanopore的优势：
- 超长读长：目前最长记录超过4 Mb
- 便携性：MinION设备仅U盘大小，可在野外、太空等极端环境使用
- 直接测序RNA：无需逆转录，可检测RNA修饰
- 实时测序：数据边测边出，可即时分析
局限性：原始读取准确性较低（约92-97%），但R10.4.1 flow cell配合Dorado basecaller的准确性已大幅提升。