三、鸟枪法蛋白质组学流程

实验部分：
1. 蛋白质提取：从细胞/组织中提取总蛋白质
2. 蛋白质定量：BCA/Bradford法测定蛋白质浓度
3. 蛋白质还原和烷基化：DTT还原二硫键，IAA烷基化保护游离巯基
4. 酶解：胰蛋白酶（Trypsin）在Lys和Arg后切割，产生肽段
5. 肽段脱盐：C18柱去除盐类和干扰物
6. LC-MS/MS分析：
- 液相色谱（nano-LC）分离肽段（通常60-120分钟梯度）
- 电喷雾离子化（ESI）进入质谱仪
- 数据依赖采集（DDA）：MS1全扫描 → 选择前N个最强离子进行MS2碎裂
- 数据非依赖采集（DIA）：MS1全扫描 → 对预设m/z窗口进行系统MS2碎裂
计算部分：
1. 数据库搜索：
- 输入：MS2谱图 + 蛋白质序列数据库
- 过程：根据母离子质量筛选候选肽段 → 预测理论碎片谱图 → 与实验谱图比对打分
- 输出：PSM列表（肽段-谱图匹配结果）
2. FDR控制：
- 目标-诱饵库策略（Target-Decoy）：构建随机或反序的诱饵数据库，与目标数据库同时搜索
- 混合搜库FDR = 2×R / (F + R)，其中F为目标库匹配数，R为诱饵库匹配数
- 分开搜库FDR = R / F
- 通常FDR < 1%作为可信鉴定阈值
3. 蛋白质组装：
- 从肽段推断蛋白质：Occam's Razor原则（用最少的蛋白质解释所有肽段）
- 处理共享肽段（不同蛋白质产生的相同肽段）
- 概率型组装（如ProteinProphet）：基于肽段置信度计算蛋白质水平概率
4. 蛋白质定量：
- 标记定量：TMT/iTRAQ的 reporter ion 强度比
- SILAC：轻/重同位素标记肽段的峰面积比
- Label-free：基于肽段色谱峰面积或谱图计数（spectral counting）
- 定量值归一化：消除系统偏差