三、代谢组学数据处理

1. 数据预处理
峰提取和比对：
- 软件：XCMS、MZmine、MS-DIAL、Compound Discoverer
- 步骤：
1. 峰检测：识别色谱峰（保留时间、质荷比、强度）
2. 峰对齐：校正不同样本间的保留时间漂移
3. 峰分组：将不同样本中对应的峰归为同一代谢物特征
4. 填补缺失值：处理零值或缺失值
缺失值处理：
- 缺失原因：代谢物低于检测限、色谱峰未检测到
- 方法：
- 低于检测限（LOD）：用LOD的一半或最小值的一半填补
- 随机缺失：KNN填补、随机森林填补
- 注意：如果缺失比例>50%，该代谢物通常被剔除
数据归一化：
- 目的：消除样本间总体差异（如取样量、稀释差异）
- 方法：
- 总离子流归一化（TIC）：每个样本的总信号归一化为相同值
- 概率商归一化（PQN）：基于QC样本的统计分布
- 分位数归一化（Quantile normalization）：使所有样本的信号分布相同
- 内标归一化：使用加入样本的内标物信号校正
数据转换：
- 对数变换（log transformation）：降低数据偏度，使分布更接近正态
- 平方根变换：适用于计数数据
- 目的：满足后续统计分析的假设（如正态分布、方差齐性）
数据缩放：
- 自相关缩放（Auto-scaling/UV-scaling）：每个代谢物减去均值，除以标准差
- Pareto缩放：除以标准差的平方根，保留较大差异的信息
- 目的：使高丰度和低丰度代谢物在分析中具有同等权重
2. 代谢物鉴定
鉴定层次（MSI, Metabolomics Standards Initiative）：
- Level 1：与标准品在相同条件下比对（保留时间、精确质量、MS/MS谱一致）
- Level 2：与公共数据库匹配（HMDB、METLIN、MassBank）
- Level 3：基于精确质量和MS/MS谱推断的候选物
- Level 4：仅知道精确质量，未知身份
数据库匹配：
- 精确质量匹配：质量误差<5 ppm（HRMS）或<50 ppm（LRMS）
- 同位素模式匹配：确认元素组成
- MS/MS谱图匹配：与数据库标准谱图比对（如METLIN、MassBank、GNPS）
- 保留时间预测：使用RT预测模型（如RIKEN Retention Time Calculator）
数据库：
- HMDB（Human Metabolome Database）：人类代谢物综合数据库，>114,000个代谢物
- METLIN：MS/MS谱图数据库，>250,000个代谢物
- KEGG：代谢通路和化合物数据库
- MassBank：高质量质谱数据库
- LipidMaps：脂质专用数据库
- CheBI：化学本体数据库
3. 统计分析
单变量分析：
- t检验/ANOVA：比较两组或多组间的代谢物差异
- fold change（FC）：差异倍数，通常|FC|>1.5或2为显著
- 火山图：同时展示FC和p-value，直观识别差异代谢物
多变量分析：
- PCA（主成分分析）：无监督降维，观察样本整体分布和聚类
- PLS-DA（偏最小二乘判别分析）：有监督降维，最大化组间差异
- OPLS-DA（正交偏最小二乘判别分析）：PLS-DA的改进版，分离预测变异和正交变异
- VIP（Variable Importance in Projection）得分：识别对组间区分贡献最大的代谢物
机器学习：
- 随机森林、SVM、神经网络：用于分类和生物标志物发现
- 交叉验证：评估模型泛化能力
- ROC曲线：评估分类性能