四、差异表达分析

（1）为什么需要专门的统计方法
RNA-seq count数据具有以下统计特征：
- 非负整数（计数数据）
- 均值与方差相关（高表达基因的方差也大）
- 存在过度离散（overdispersion，方差>均值）
- 很多基因在部分样本中count为0（零膨胀）
因此不能使用普通t检验或ANOVA，需要专门的方法。
（2）DESeq2
基于负二项分布（Negative Binomial）模型：
1. 估计大小因子（Size Factor）：校正测序深度差异
$$size_factor_i = median_j \left( \frac{K_{ij}}{\left( \prod_{v=1}^{m} K_{vj} \right)^{1/m}} \right)$$
2. 估计离散度（Dispersion）：每个基因的变异程度
- 使用经验贝叶斯收缩（shrinkage）稳定低表达基因的离散度估计
3. 拟合广义线性模型（GLM）：
$$K_{ij} \sim NB(\mu_{ij}, \alpha_i)$$
$$\log_2(\mu_{ij}) = \beta_0 + \beta_1 \cdot condition_j$$
4. Wald检验：检验系数β₁是否显著不为0
5. 多重检验校正：使用Benjamini-Hochberg方法控制FDR
（3）edgeR
同样基于负二项分布，但使用不同的离散度估计策略：
- 使用经验贝叶斯（empirical Bayes）从所有基因中借用信息
- 对小样本量（n<5）有较好的表现
差异表达基因的筛选标准：
- |log₂FC| ≥ 1（表达量变化≥2倍）
- padj < 0.05（校正后p值）