三、表观转录组学技术

1. 基于亲和纯化的方法
MeRIP-seq（m⁶A-seq）：
- 原理：m⁶A特异性抗体免疫沉淀 → 测序
- 分辨率：约100-200 nt（依赖片段大小）
- 优点：广泛应用，可检测多种修饰
- 缺点：分辨率低，不能精确定位到单碱基
m⁶A-label-seq：
- 原理：使用Se-烯丙基-L-硒基同型半胱氨酸替代m⁶A形成a⁶A，可被抗体富集，碘诱导环化后在反转录中产生碱基错配
- 分辨率：单碱基
- 限制：仅适用于细胞培养，不能用于组织样本
2. 基于反转录诊断事件的方法
miCLIP（m⁶A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation）：
- 原理：254 nm UV交联 → m⁶A抗体免疫沉淀 → 反转录中m⁶A位点附近产生C→T突变或截断 → 测序
- 分辨率：单碱基
- 优点：分辨率高
- 缺点：交联效率低，只能鉴定部分位点
PA-m⁶A-seq：
- 原理：将4SU整合到mRNA → 365 nm UV交联 → 抗体免疫沉淀 → 反转录中4SU附近U被误读为C → 约20 nt分辨率
RNA-BisSeq（m⁵C检测）：
- 原理：亚硫酸盐处理RNA → 未修饰C→U，m⁵C保留 → 测序
- 注意：RNA亚硫酸盐处理条件比DNA更苛刻
Ψ检测方法：
- CMC处理：羧甲基纤维素（CMC）在Ψ位点引入庞大基团，导致反转录终止
- PSI-Seq/Pseudo-Seq/CeU-Seq：基于CMC的Ψ检测方法
- RBS-Seq：亚硫酸盐处理RNA，Ψ位点产生碱基缺失
m¹A检测：
- m¹A-MAP/m¹A-seq-TGIRT：基于m¹A在反转录中诱导碱基错配，使用耐高温TGIRT酶增加错配率
3. 基于化学或酶抗性的方法
RiboMeth-seq（2'-O-Me检测）：
- 原理：2'-O-Me增强磷酸二酯键对碱水解的抗性 → 有2'-O-Me的位点保护相邻核苷酸不被降解 → 测序后检测保护末端
- 缺点：背景高，需要高测序深度
Nm-seq：
- 原理：无2'-O-Me的3'端核苷酸被高碘酸盐氧化后降解，有2'-O-Me的则保留 → 富集3'端有2'-O-Me的片段
- 缺点：碎片化偏好性，需要多次氧化循环
Nm-REP-seq：
- 原理：结合MgR酶消化（在2'-O-Me前一位停顿）和化学处理（在2'-O-Me位点停顿）→ 两种方法共同验证，降低假阳性
4. 基于第三代测序的方法
ONT纳米孔测序：
- 原理：DNA/RNA通过纳米孔时产生特征性电流信号，甲基化修饰改变电流特征
- 优点：无需亚硫酸盐处理，长读长，可区分多种修饰
- 缺点：错误率较高，需要高深度
- 软件：EpiNano（用于m⁶A、Ψ、2'-O-Me鉴定）
PacBio SMRT测序：
- 原理：实时监测DNA聚合酶动力学，修饰碱基影响聚合速率（脉冲间隔）和信号强度（脉冲宽度）
- 优点：单分子分辨率，可同时检测序列和修饰
- 缺点：通量较低，成本高