四、表观转录组学数据分析方法

1. 基于亲和纯化数据的峰识别
exomePeak：
- 原理：IP样本 vs. input样本，计算每个位点的修饰程度（IP / (IP + input)）
- 统计检验：C-test（基于二项分布）
- 优点：考虑了整体修饰水平
MACS2：
- 可直接用于RNA修饰IP数据（类似ChIP-Seq peak calling）
- 动态泊松分布建模背景
MeTPeak：
- 采用分层β-二项模型模拟读段富集方差
- 使用隐马尔可夫模型解释相邻富集的依赖性
CTK：
- 使用"寻谷算法"（valley-seeking）分离重叠峰
- 计算相邻局部最大值之间的谷深度，判断是否应分为两个峰
- 支持多种背景模型和扫描统计
2. 基于反转录诊断事件的单碱基鉴定
CTK/miCLIP数据分析：
- 关注诊断事件：突变（C→T）、截断、缺失
- 对于每个候选位点，计算：
- k：覆盖该位点的总reads数
- m：具有特定诊断事件的reads数
- 使用排列检验（permutation test）评估显著性：
- 随机将突变插入到其他reads中（保持相对于5'端的偏移）
- 比较实际数据和排列数据中(k, m)的分布
- 为每个位点分配经验FDR
- 额外过滤：排除与已知SNP重叠的位点，检查"RRAC"模体（m⁶A consensus）
PARalyzer：
- 分析用户指定的突变类型
- 通过聚类和统计检验识别高置信度修饰位点
3. 基于化学/酶抗性的数据鉴定
endSeeker（Nm-REP-seq数据分析）：
- 计算每个转录本位置的3'端覆盖度
- 候选位点应满足：
- 覆盖度显著高于上下游各1 nt
- 覆盖度显著高于对照组（未处理样本）
- 计算四个变量：
- upFC = 候选位点覆盖度 / 上游1 nt覆盖度
- downFC = 候选位点覆盖度 / 下游1 nt覆盖度
- upCtrlFC = upFC / 对照组upFC
- downCtrlFC = downFC / 对照组downFC
- 结合四个变量筛选高置信度2'-O-Me位点
4. 基于第三代测序的修饰鉴定
EpiNano-Error模式：
- 比较修饰酶敲除/敲低样本与野生型样本
- 分析碱基识别错误（突变、缺失、插入）的频率差异
- 基于错误模式差异预测修饰位点
EpiNano-SVM模式：
- 使用已知修饰位点训练SVM模型
- 提取纳米孔测序信号特征（电流、持续时间等）
- 预测新样本中的修饰位点
5. RNA修饰位点分布分析
Meta-gene分析（MetaPlotR）：
- 将转录本坐标归一化为元坐标：
- 5'UTR：0-1
- CDS：1-2
- 3'UTR：2-3
- 绘制修饰位点在元基因模型上的分布
- 揭示修饰特征：如m⁶A在终止密码子附近富集
Motif分析：
- m⁶A："RRAC" consensus motif
- 在鉴定位点周围搜索显著富集的序列模式
- 使用MEME、DREME等工具
6. 差异RNA修饰分析
Differential m⁶A分析：
- 比较两组样本（如疾病 vs. 正常）的m⁶A水平
- 方法：exomePeak2、MeTDiff、QNB（基于β-二项模型）
- 输出：差异甲基化位点或区域，以及关联的基因