三、表达量定量

（1）基于count的方法
统计比对到每个基因区域的reads数。
- featureCounts：快速、准确，广泛使用的计数工具
- HTSeq-count：早期标准工具，灵活性高
（2）基于比对的定量（RPKM/FPKM/TPM）
原始count需要标准化才能进行样本内和样本间比较：
- RPKM（Reads Per Kilobase of exon per Million mapped reads）：
$$RPKM = \frac{ reads \times 10^9 }{ gene_length \times total_mapped_reads }$$
- FPKM（Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped fragments）：
与RPKM类似，但使用fragment（pair-end测序中的一对reads）代替reads
- TPM（Transcripts Per Million）：
$$TPM_i = \frac{ RPKM_i }{ \sum_j RPKM_j } \times 10^6$$
TPM vs FPKM的关键区别：
- FPKM先标准化到总reads数，再除以基因长度
- TPM先除以基因长度得到RPKM-like值，再标准化到总和为10⁶
- TPM的优势：所有样本的TPM总和相同（10⁶），更适合样本间比较
- FPKM的问题：样本间总FPKM不同，受高表达基因影响大
（3）基于转录本估计的定量（Salmon, Kallisto, RSEM）
不依赖基因组比对，直接从reads推断转录本丰度：
- 使用伪比对（pseudoalignment）或EM算法
- 速度极快（Kallisto比传统方法快约100倍）
- 可直接输出TPM值