二、二代测序：Illumina SBS技术

Illumina测序流程包括四个关键步骤：
（1）文库制备
- 将基因组DNA随机打断成200-500 bp片段
- 末端修复、加A尾、连接测序接头（adapter）
- PCR扩增文库（可选）
（2）Flow Cell杂交与桥式PCR
- Flow Cell表面固定有两种与接头互补的引物
- 单链DNA文库与引物杂交
- 通过桥式PCR扩增：DNA片段弯曲成桥状，以另一端为模板进行扩增
- 经过多轮扩增，每个原始分子形成一个约1000-2000个克隆的"簇"（cluster）
- 变性后得到单链簇，作为测序模板
（3）边合成边测序（SBS）
- 加入DNA聚合酶和四种带有不同荧光标记的dNTP（每种dNTP的3'-OH被可切除的化学基团阻断）
- 每个循环：
a. 四种dNTP竞争掺入，每次只有一个碱基被加入
b. 激光扫描，根据荧光颜色确定掺入的碱基
c. 切除荧光基团和3'阻断基团，使链可以继续延伸
- 重复上述循环，逐碱基读取序列
（4）双端测序（Paired-End Sequencing）
- 从簇的两端分别测序，获得两段各约150 bp的序列
- 两段序列之间距离已知（约200-500 bp）
- 双端信息对于基因组组装和结构变异检测至关重要
数据格式与质量控制
测序数据以FASTQ格式存储，每条记录包含四行：序列标识符、碱基序列、"+"分隔符、碱基质量值（Phred分数）。Phred质量值Q与碱基错误率ε的关系为：Q = -10log₁₀(ε)。Q30表示碱基错误率约为0.1%，即准确性为99.9%。