二、代谢组学实验设计

1. 样本收集与制备
样本类型：
- 生物体液：血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液、胆汁
- 组织样本：肝脏、肌肉、肿瘤、脑组织
- 细胞样本：培养细胞、原代细胞
- 其他：粪便、肠道内容物、发酵液
质控样本：
- QC样本（Quality Control）：混合等量的所有实验样本，用于监测系统稳定性和数据质量
- 空白样本：溶剂空白，评估背景污染
- 标准品：已知浓度的代谢物混合物，用于方法验证
样本制备：
- 蛋白质沉淀：甲醇/乙腈/氯仿提取，去除大分子
- 脂质去除：如需分析极性代谢物，使用正己烷或氯仿去除脂质
- 衍生化：GC-MS需要硅烷化（BSTFA+TMCS）或甲基化
- 注意：不同代谢物类别需要不同的提取方法，没有"一刀切"的最佳方案
2. 仪器分析
色谱条件优化：
- 色谱柱选择：C18（反相）、HILIC（亲水）、T3（混合模式）
- 流动相：水/乙腈或水/甲醇，含0.1%甲酸或5mM乙酸铵
- 梯度洗脱：从低有机相到高有机相，洗脱不同极性的代谢物
- 流速：200-400 μL/min（nano-LC更低）
质谱参数：
- 离子源：ESI+（正离子模式，检测碱性代谢物如氨基酸、胺类）和ESI-（负离子模式，检测酸性代谢物如脂肪酸、有机酸）
- 采集模式：Full scan（全扫描）+ DDA（数据依赖MS/MS）或DIA（全离子碎片）
- 分辨率：Orbitrap 60,000-120,000（Full scan），15,000-30,000（MS/MS）
- 扫描范围：m/z 50-1000（或更宽）
3. 数据质量监控
QC样本分析：
- 每5-10个样本插入一个QC样本
- 监测保留时间漂移、信号强度变化、峰形变化
- 评估标准：QC中代谢物峰的RSD（相对标准偏差）<20%（或30%）
批次效应评估：
- PCA分析：检查QC样本是否聚类，样本是否按批次聚集
- 如果样本按批次分离，说明存在显著批次效应，需要校正