三、Seurat分析流程

Seurat是scRNA-seq分析最广泛使用的R包，由Satija Lab开发。
标准分析流程：

原始数据 (Cell Ranger输出)
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创建Seurat对象
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质控过滤 (nFeature, nCount, percent.mt)
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标准化 (LogNormalize, SCTransform)
    ↓
高变基因选择 (FindVariableFeatures)
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缩放 (ScaleData)
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线性降维 (PCA)
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非线性降维 (UMAP/t-SNE)
    ↓
聚类 (FindNeighbors + FindClusters, Louvain算法)
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细胞类型注释 (marker基因/自动注释)
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差异表达分析 (FindAllMarkers)
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可视化 (DimPlot, FeaturePlot, VlnPlot)

（1）质控
- nFeature_RNA：每个细胞检测到的基因数。过低（<200）可能是死细胞/空液滴；过高（>5000-8000）可能是双细胞
- nCount_RNA：每个细胞的总UMI数。与nFeature相关
- percent.mt：线粒体基因比例。过高（>10-20%）提示细胞膜破损，细胞质RNA流失
（2）标准化
- LogNormalize：对每个细胞的总UMI数进行标准化，然后取log1p
$$norm_count = \log\left( \frac{count}{total_UMI} \times 10000 + 1 \right)$$
- SCTransform：使用正则化负二项回归进行标准化，同时去除技术变异（如测序深度影响），效果通常优于简单标准化
（3）降维与聚类
- PCA：线性降维，保留主要变异方向
- UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）：非线性降维，保留局部结构的同时拉开不同聚类
- Louvain聚类：基于共享最近邻（SNN）图的社区检测算法
（4）细胞类型注释
- 根据已知marker基因的表达进行手动注释
- 或使用自动注释工具（SingleR, scCATCH, celldex）
- 常用marker：
- T细胞：CD3D, CD3E
- B细胞：CD79A, MS4A1
- 单核/巨噬细胞：CD14, LYZ
- NK细胞：NKG7, GNLY